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斑馬魚在神經功能環路研究中的應用

時間:2016-07-13來源:本站作者:玉研儀器

摘要:斑馬魚是發育、遺傳以及藥物發現研究中常用的模式動物。作為重要的脊椎動物模式系統之一,斑馬魚與人類基因有高度同源性,中樞神經系統也與哺乳動物相似。近來,斑馬魚在神經科學研究以及生理心理學相關問題的研究中的應用日益廣泛。研究者們對斑馬魚幼魚及成魚的行為表現及行為發育開展了多方面的研究。基于斑馬魚模式動物的特點及優勢,遺傳突變和藥物篩選在對動物行為表現的分子機制的研究中起到重要的推動作用。 

  1.前言 

  人類的心理活動控制行為表現,外在行為是內在心理的表現。心理異常將導致認知、情緒等方面的疾病。認識各種心理現象的內在細胞分子機制有助于我們更好地了解心理相關疾病,發現可能的治療方法。人類腦成像及遺傳相關性研究證實心理現象與在動物中保守的分子及基因相關,而更多對其神經環路機制的認識來自動物模型的研究。斑馬魚是發育、遺傳以及藥物發現研究中常用的模式動物。斑馬魚模式動物具有良好的遺傳可操作性,便于開展對斑馬魚轉基因動物及基因敲除動物的研究。相比小鼠,斑馬魚模式動物具有個體小,易繁殖,產卵力高等特點(Grunwal&Eisen2002;賈順姬,孟安明,2012)。這使得斑馬魚模式動物適用于高通量的行為分析檢測(Granato et al.1996)以及對活性化合物的篩選(Rihel et al.2010WolmanJainLiss&Granato2011)。基于這些特點,斑馬魚模式動物可以在神經功能環路的分子遺傳基礎研究以及篩選影響環路功能活性化合物的研究當中發揮較獨特的作用。 

  斑馬魚成魚與幼魚都可用于行為學實驗來檢測神經環路的功能。幼魚由于其相對簡單的行為,有限的行為參數以及高通量等特點被更普遍地應用。而成魚具有更為多樣的行為及生理反應,可進行更復雜實驗的行為分析。在本文中,我們將首先簡述斑馬魚中幾種常用的行為模型以及當前對斑馬魚行為發育的研究。然后我們將介紹斑馬魚糖皮質激素受體基因突變的研究與人抑郁癥機制之間可能的關系,并介紹高通量活性化合物篩選應用于睡眠、非聯合型學習等行為的機制研究的結果。最后,我們將展望TALEN基因敲除技術在神經功能環路研究中可能的應用。 

  2.行為模型 

  2.1感覺運動反應 

  斑馬魚幼魚在1周左右時就能表現出許多特定的刻板反應(Wolman&Granato2012)。通過特定的感覺刺激即可誘發這些顯著的運動反應,即感覺運動反應。已知神經基礎的感覺運動反應可用于基因正向篩選。George Streisinger是最早將斑馬魚作為模式生物用于神經系統發育研究的遺傳學家。上世紀70年代,Streisinger及其同事利用γ射線誘發視覺缺陷的突變體用于視覺引導行為相關基因的研究(ChakrabartiStreisingerSinger&Walker1983Walker&Streisinger1983)。隨后,Nusslein-VolhardBonhoefferDriever實驗室利用斑馬魚幼魚進行大規模基因篩選(Driever et al.1996Haffter et al.1996),后續的工作從中發現了數百個突變,能夠影響由視覺和觸覺引起的感覺運動(Granato et al.1996Neuhauss et al.1999)。其中部分突變的基因已被克隆并識別,用于研究相關的人類神經系統疾病。 

  簡單的感覺運動行為并非對刺激簡單不變地響應,同時還受到更高級別神經基質的調控。例如脊椎動物中保守的聲驚嚇反應還受環境和經驗的調節。研究發現強刺激前出現一個微弱的非驚嚇聲刺激會抑制驚嚇反應,即前弱刺激抑制(prepulse inhibition)。利用這一現象,BurgessGranato篩得前弱刺激抑制減弱突變株,表明斑馬魚在受精后5天時感覺門控已經具有功能(Burgess&Granato2007)。除了前弱刺激抑制,研究發現單一重復的聲驚嚇刺激會導致驚嚇反應迅速減弱,即適應。運用不同的行為策略研究聲驚嚇反應有助于了解感覺信息處理,學習及認知功能障礙的潛在神經機制。 

  2.2情感和記憶相關行為 

  2.2.1黑白偏好 

  研究顯示斑馬魚對于光照表現出顯著的選擇行為,成魚具有避開光亮環境的本能。自由狀態下,斑馬魚選擇在黑暗區域呆更長時間,這種行為可維持至少幾十分鐘。有意思的是對于光亮環境,斑馬魚幼魚(12周)則表現出偏好而非回避。作為發育進程調控的選擇逆轉,該現象的內在神經基礎仍待進一步研究。 

  Lau等證實黑白選擇行為與情緒及激勵相關(LauMathurGould&Guo2011)。他們將抗焦慮藥作用于成魚,結果顯示光回避行為減少,同時視覺及運動能力不受影響。此外,基于c-los的神經活動映射技術顯示背側前腦區(Dm)的內側區以及腹側前腦區(Vm)的背側核在黑白選擇過程中被激活。而這兩個區域分別對應哺乳動物的杏仁核與紋狀體。眾所周知,杏仁核和紋狀體參與情緒及激勵行為的調控。因此,黑白偏好選擇可能提供了一種探索情感及激勵行為細胞分子基礎的行為模型。 

  2.2.2新魚缸實驗 

  與嚙齒動物的曠場實驗類似,新魚缸實驗也利用了動物處于不熟悉環境中會尋求保護的本能。與其他物種相同,暴露于新環境中,斑馬魚會表現出顯著的焦慮行為,如潛游、靜止不動以及減少探索游動。直到新環境逐漸熟悉后,他們才會四處探索。利用該實驗模型,研究者可通過收集和比較一系列行為參數來評價實驗動物的焦慮水平,例如靜止時間、進入上半部分的次數、上半部分游動時間。在研究藥物抗焦慮或致焦慮效果時,可利用該實驗模型進行篩選(cachat et al.2010)。盡管能夠提供大量行為參數,同時已經有廣泛的應用,新魚缸實驗并不適用于所有行為學領域(如藥物獎勵類型)及焦慮行為(如黑白偏好)。因此,斑馬魚曠場實驗,黑自盒實驗,Y-T-迷宮實驗等新環境實驗模型可作為新魚缸實驗的補充,從而綜合評價斑馬魚神經行為表現的特性。   2.2.3條件性位置偏好 

  條件性位置偏好實驗中,一中性刺激通過與有激勵作用的非條件刺激反復匹配,從而誘導出趨向行為。在研究藥物濫用及成癮的嚙齒動物模型中,CPP行為廣泛存在。而第一例斑馬魚成魚CPP行為由DarlandDowling2001年發表(Dadand&Dowling2001)。他們將魚缸兩側的視覺提示作為中性刺激,首先評定實驗動物的自然偏好,之后將成魚限制在不喜歡的一側,施以可卡因,成功誘導出偏好行為。之后,許多實驗室也采用斑馬魚CPP模型測定其他物質的強化效應。然而CPP的神經環路基礎仍不清楚。在CPP顯示的眾多神經物質中,多巴胺可能是哺乳動物中研究最為透徹的。而在斑馬魚CPP模型中,多巴胺對行為表現也起決定性作用。多巴胺神經元突觸前后參與該環路的其他神經元類型,聯合型學習在該環路的發生位置仍待進一步研究。 

  2.2.4條件性位置回避 

  條件性位置回避與CPP概念相似,但行為結果相反,即一中性刺激反復與具有負面效應的非條件刺激匹配,從而誘導出回避行為。斑馬魚條件性主動回避實驗裝置為一穿梭盒,中間被不透明屏障分為兩個相等區域,水下連通,斑馬魚可自由游動。成魚為避免電擊必須穿過屏障,一側的電擊與對側的光信號匹配。經過訓練,斑馬魚學會在測試開始10秒內游入照亮的一側從而避免電擊。CPA模型被用于研究恐懼反應的經驗依賴性緩解,證明僵核在其中發揮作用(Agetsuma et al.2010Lee et al.2010)。而CPA模型的神經基礎仍有許多未解之謎,如參與回避反應的神經元件以及這些元件如何通過學習被一個最初低效價信號所激活。 

  2.2.5群聚行為等其他行為 

  群聚行為是包括斑馬魚在內的許多小型魚類的一種社會行為,對防范捕食者及增強覓食能力起著重要的作用。研究顯示斑馬魚具有顯著且可重復的群聚行為,隨著年齡的增長群聚行為增強(EngeszerRyan&Parichy2004Miller&Gerlai2007)。在該實驗模型中,魚群的疏密程度可反映魚群的焦慮水平。在致焦慮刺激的作用下,魚群變得更緊密。反之,當魚群處于低焦慮狀態時,個體更易從魚群中脫離,魚群也更為疏散。因此,研究者可通過魚群個體間平均距離及最近個體距離等參數來評估魚群焦慮水平。該模型可用于研究社會行為潛在的神經環路以及藥物濫用對社會行為的影響。 

  新物體接近實驗也是一種新環境實驗模型。不同于其他新環境實驗,新物體接近實驗通過在熟悉的環境中導人外源物體引起斑馬魚的焦慮行為(WrightNakamichiKrause&Butlin2006)。研究者可通過分析接近新物體所花的時間,接近的頻率,靜止時間及次數等行為參數來評價實驗動物的焦慮水平。此外,新物體接近實驗還可用于研究捕食者回避及社會行為。 

  捕食和避免被捕食在動物生存和進化過程中起著重要作用。暴露于自然界的捕食者,如印度葉魚,能誘發斑馬魚的恐懼及類焦慮行為(Bass&Gerlai2008)。捕食者回避實驗通常采用雙臂裝置,將捕食者置于其中一個臂中,實驗動物對捕食者回避或接近的行為趨勢就體現了其恐懼或焦慮水平。研究者可通過分析實驗動物與捕食者同處一臂的時間,進入捕食者所在臂的次數以及第一次進入捕食者所在臂的時間等行為參數評估外源刺激或內源基因表達改變對其恐懼或焦慮行為的影響。 

  3.行為發育 

  3.1行為的個體發育 

  個體發育在經典條件反射模型系統中已得到深入研究,近年更是在分子及發育神經生物學方面取得了進展。運用條件反射模型有助于揭示個體發育的神經環路基礎,了解其發育及整合各部分行使行為和可塑性調控的過程。斑馬魚作為模式生物可實現對神經發育及活動的實時活體成像,近年來在個體發育研究中越來越受到關注。Valente等利用經典和操作性條件反射實驗研究斑馬魚發育過程中學習行為的出現(ValenteHuangPortugues&Engert2012)。通過記錄受精后7天至8周斑馬魚的行為表現,實現對發育過程中學習行為的連續研究。結果顯示學習行為開始于第3周,到第6周時達到成年水平,在整個發育過程中都不斷提高。成魚經學習短時間內即可表現優異,且學習行為明顯受視覺調控。成魚的記憶至少6小時可在行為上檢測,至少12小時之后仍可再激活。該結果與鼠中的研究結果一致:條件反射在發育過程中具有時間窗口。通過行為模型的研究找到個體發育過程中學習等行為形成關鍵時間點能夠為之后的研究提供方向。而斑馬魚眾多的轉基因株系也為個體發育中信號通路、基因調控等的研究提供了有力的研究工具。 

  3.2幼魚的非聯合適應性學習 

  非聯合適應性學習(fnon-associative habituation learning)作為一種簡單的學習形式,使生物能夠根據最近受到的刺激調整對感覺輸入做出的行為反應。適應反映了對重復非重要刺激的抑制行為反應,同時也是神經系統過濾非相關刺激的一種機制。大量不同模式生物的適應性學習研究中所采用的參數及規則相似,提示其潛在分子機制的保守性。斑馬魚幼魚具有簡單明確固定的感覺運動行為,如O型彎、C型彎等,使其成為研究神經環路與高通量遺傳及化學篩選的優良脊椎模式生物。研究證實采用重復視覺刺激的間隔訓練模塊法能引起幼魚的長期適應(WolmanJainLiss&Granato2011),使由刺激引起的特定感覺運動行為的改變恢復至正常水平。這一過程長達24小時且需要蛋白質合成。而重復聲刺激能誘導產生顯著的短期適應。該過程受刺激頻率以及多模態刺激引起的瞬時性非適應的調節。由于其分子機制的保守性,可利用斑馬魚幼魚進行高通量分子篩選,檢測包括各類受體激動劑或拮抗劑等在內的小分子物質對于非聯合適應性學習的作用。 

  4.遺傳突變及藥物篩選與神經系統功能環路研究 

  4.1糖皮質激素受體突變與抑郁   應激反應主要由下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸調節,下丘腦促。腎上腺皮質激素釋放激素(eortieotropin-releasing hormoneCRH)合成和釋放增加從而促進垂體釋放促腎上腺皮質激素。而促·腎上腺皮質激素則刺激腎上腺產生糖皮質激素。在斑馬魚和人類中,主要的糖皮質激素均為皮質醇。人類抑郁癥患者病癥之一即為HPA軸調節異常,皮質醇維持高水平。但HPA軸與抑郁癥之間的聯系仍不清楚。在神經系統中,皮質醇結合糖皮質激素受體(GR)后能夠調控特定靶向基因的轉錄,包括應激相關的促腎上腺皮質激素釋放激素和促腎上腺皮質激素,實現負反饋。GRDNA結合序列在進化中高度保守。在HPA軸功能正常的人類中,GR的人工配體地塞米松會抑制皮質醇的表達。而抑郁病人的HPA軸活動增強,地塞米松的抑制效果也顯著遲緩。這證明糖皮質激素抵抗至少是抑郁癥的某種形式。Baier實驗室篩得一斑馬魚突變株,其GR的單堿基突變導致轉錄調控活性的缺失,應激反應負反饋被打斷(Griffiths et al.2012Ziv et al.2012)。GR突變株HPA軸活動增強,地塞米松對皮質醇的抑制效果遲緩,輕度壓力使其類抑郁行為增加。新魚缸實驗顯示突變株靜止增多,探索行為減少,重復實驗無適應現象。人類抗抑郁藥氟西汀和苯甲二氮卓則可使行為恢復正常,這一結果與人類中的結果一致,提示脊椎動物HPA軸與情感障礙之間聯系的保守性,進一步證明糖皮質激素抵抗,而非過多的糖皮質激素受體信號,促進了抑郁癥的發展。而糖皮質信號在情感行為的調控過程中具有保護功能。該突變株有助于深入研究GR在應激反應中的作用,也使高通量篩選新型抗抑郁藥物成為可能。 

  4.2藥物篩選與睡眠、非聯合型學習 

  傳統脊椎動物學習行為的研究需進行行為訓練,測試大量動物,費時且難以應用于大規模遺傳學及小分子篩選。因此,傳統大規模藥物篩選主要采用體外篩選方法,但無法反映對整體動物行為的影響,尤其對精神類藥物來說是一大局限。目前已鑒定出8000余種斑馬魚突變株,可模擬貧血、耳聾、視網膜變性、肌無力癥、惡性腫瘤和阿爾茲海默癥等多種人類疾病,可作為研究人類疾病的模型。利用這些模型,可簡單高效地對相關疾病進行藥物篩選,尤其對于斑馬魚發育早期行為有影響的藥物進行高通量篩選。在96孔板中放入斑馬魚幼魚,在各個孔中施以不同種類不同濃度的小分子物質,利用視頻跟蹤系統記錄幼魚行為數據,對特定行為參數進行軟件分析即可得知各類小分子對于該行為的作用效果。 

  Rihel實驗室采用斑馬魚幼魚睡眠/覺醒行為實驗,通過測定睡眠次數、睡眠時間及覺醒活動等行為參數可實現小分子化合物的多維定量篩選(Rihel et al.2010)。高通量低消耗的斑馬魚行為實驗可作為傳統藥物篩選方法的補充,有助于發現體外實驗無法察覺的藥效、副作用等。此外,行為檢測有助于解析睡眠/覺醒等復雜行為的藥理學特性,同時了解機理未知的化合物的作用機制。而Wolman等提出一種基于斑馬魚幼魚非聯合型學習行為的自動化高通量系統(Wolman et al.2011)。斑馬魚幼魚具有顯著的短期適應,其神經環路已知。利用這一優勢,他們對已知靶點的生物活性化合物進行高通量篩選。結果表明測試化合物的功能在斑馬魚幼魚與哺乳動物間高度保守,但仍發現幾種化合物以前未知的學習行為調控功能。這提示了高通量化學篩選配合高分辨率行為分析是發現新型認知調控分子的有力方法。 

  4.3TALEN技術 

  TALEN技術(transeription activator-likeTALeffector nucleases)是一種嶄新的分子生物學工具。研究發現來自植物細菌Xanthomonas印。的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系(Boch et al.2009)。利用TAL的序列模塊,可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白,從而達到靶向操作內源性基因的目的。TALEN技術可構建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶,在特異的位點打斷目標基因DNA,進而在該位點進行DNA操作,如KnockoutKnock-in或點突變。它克服了基于鋅指蛋白的ZFN方法不能識別任意目標基因序列,以及識別序列經常受上下游序列影響等問題,而具有ZFN相等或更好的活性,使基因操作變得更加簡單、方便。該技術已在斑馬魚上成功應用,且操作簡便,成本低廉,效率還很高。通過顯微注射技術,將合成的特定基因TALEN片段注入斑馬魚受精卵即可實現靶向基因敲除。實驗結果顯示,TALEN技術在斑馬魚中基因敲除效率普遍可達到70%以上,個別可到達幾乎100%。配合高效的TALEN合成技術,即可實現高通量基因敲除株的建立。目前,運用該技術已得到數百種基因敲除突變株,為進一步研究基因的功能及其對行為的影響提供了強有力的工具。此外,斑馬魚中有上百種未知功能的非編碼RNA,運用傳統研究手段很難找到突破口。通過TALEN技術在斑馬魚中的高效應用,可在短時間內獲得百余個非編碼RNA基因敲除株,對基因敲除動物進行觀察和行為檢測即可了解這些非編碼RNA在發育及行為過程中是否發揮了作用,為非編碼RNA的研究打開了突破口。隨著TALEN技術的日益完善,最終將成為每個實驗室都能掌握的強大實驗工具,毫無疑問將有助于對各類基因功能的深入研究。 

  5.展望 

  心理紊亂會引發多種心理疾病,多伴有生理系統尤其是神經系統的功能異常。盡管存在許多不同,斑馬魚基本心理活動的外在行為表現與人類相似。作為一種簡單的脊椎動物模型,斑馬魚行為模型避免了復雜神經系統對行為的綜合調控,有利于發現行為調控的基本神經環路,使我們能在細胞分子水平上研究抽象心理過程如何調控具體行為表現。隨著斑馬魚行為研究的深入,實驗方法及行為參數分析趨于穩定,同時新的行為模型不斷出現應用于各類研究,這都將有利于斑馬魚行為學實驗的推廣,為各類研究提供新的途徑。

 

 

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